บทที่ 5

วิจารณ์ผลการทดลอง

จากการทดลองโดยใช้หัวย่อยของช่อทับทิม พบว่าอิทธิพลของทั้งสองปัจจัยการทดลองคือความเข้มข้นและระยะเวลาที่ให้สารละลายโคลชิซีนมีผลต่อจำนวนวันเมื่อเริ่มงอก ซึ่งจะช้าลงเมื่อมีการให้สารละลายโคลชิซีน โดยเฉพาะเมื่อใช้ความเข้มข้นสูง ดังเช่นอิทธิพลของความเข้มข้น ที่ไม่ใช้สารละลายเลยจะใช้เวลางอกน้อยที่สุด และใช้เวลามากที่สุด เมื่อให้ความเข้มข้นสูงสุดโดยงอกช้าลงถึง 4 วัน (ตาราง 3) และในแนวทางเดียวกัน การใช้ระยะเวลาในการแช่หัวย่อย 1 วันจะทำให้จำนวนวันเริ่มงอกน้อยที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับจำนวนวันแช่อื่นๆ (ตาราง 1) ผลที่เห็นได้ชัดเมื่อใช้เวลานาน 4 และ 6 วัน ร่วมกับการใช้ความเข้มข้นสารละลายสูงสุด (ตาราง 5) ผลนี้เป็นไปในทางเดียวกันกับรายงานของ วิมล และ อนันต์ (2526) ซึ่งได้ทำการทดลองกับพริกไร่ (Capsicum sp.) และ วิมล (2527) ที่ทำการทดลองกับข้าว จำนวนวันเฉลี่ยเมื่องอกถึงห้าสิบเปอร์เซนต์ ผลที่ได้เป็นไปในทางเดียวกันกับจำนวนวันเฉลี่ยเมื่อเริ่มงอก ซึ่งเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบการที่ไม่ให้สารละลายโคลชิซีนเลย กับเมื่อใช้ความเข้มข้นมากที่สุดคือ 0.24 % พบว่ามีความแตกต่างกันถึง 5 วัน (ตาราง 3 ) ส่วนระยะเวลาการแช่หัวย่อย พบว่าเมื่อแช่นานถึง 6 วัน ทำให้เวลางอกนานมากที่สุด คือ 37.67 วัน สำหรับการงอกของหัวย่อยทั้งหมดก็พบว่าเมื่อใช้ความเข้มข้นสูงสุดคือ 0.24 % มีเปอร์เซนต์การงอกต่ำที่สุด (ตาราง 1) นอกจากผลด้านเวลาการเริ่มงอกดังที่กล่าวมาแล้ว เปอร์เซนต์การงอก เปอร์เซนต์รอดตาย และผลต่อการออกดอก พบว่าผลร่วม (interaction) ระหว่างปัจจัยทดลองทั้งสองก็ไม่แสดงความสัมพันธ์ชัด ในขณะที่จำนวนต้นงอกน้อยที่สุดได้จากการใช้ความเข้มข้นสูงสุดร่วมกับเวลาแช่นานที่สุด

การตรวจหาโครโมโซมจากปลายรากของหัวย่อยช่อทับทิม ซึ่งมีจำนวนโครโมโซมแบบปกติคือ 2n=3x=48 พบว่ามีการเปลี่ยนแปลงจำนวนโครโมโซมแบบ aneuploid (2n+x) ในจำนวนต่างๆ จากการที่ให้สารละลายความเข้มข้นต่างๆ ซึ่งเห็นได้ชัดว่าจำนวนโครโมโซมที่พบไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อไม่ใช้สารละลายโคลชิซีน (ตาราง 8) ส่วนอิทธิพลของเวลาการแช่ 4 และ 6 วัน ก็ให้จำนวนเซลล์ที่มีโครโมโซมแบบ aneuploid มากกว่าเมื่อใช้เวลาแช่น้อยกว่า โดยพบว่าโครโมโซม aneuploid แบบเพิ่มจำนวนโครโมโซม พบในช่วง 49-54 แท่ง และ aneuploid แบบลดจำนวนโครโมโซมลง พบจำนวนโครโมโซมในช่วง 26-47 แท่ง ผลร่วมของปัจจัยทั้งสองที่ทดสอบแสดงผลด้านความสัมพันธ์กันส่งเสริมกันเมื่อใช้ความเข้มข้นมาก และใช้เวลานานขึ้น โดยเฉพาะ 4 และ 6 วัน จากการทดลองนี้จะเห็นว่าช่อทับทิมมีจำนวนโครโมโซมตามธรรมชาติเป็นทริพพลอยด์ ซึ่งถูกชักนำให้เพิ่ม หรือลดจำนวนได้ แต่ไม่เกิดเป็นพลอยด์ดีที่เพิ่มจำนวนเท่าของ basic number เลย อาจเป็นเพราะความเข้มข้นหรือเวลายังไม่เหมาะสม จากอิทธิพลของสารละลายโคลชิซีน ความเข้มข้นที่ใช้ จากการทดลองครั้งนี้ แม้ว่าจำนวนต้นเมื่องอกทั้งหมดจะลดลง และงอกช้าลงบ้าง เมื่อใช้เวลานานที่สุดร่วมกับความเข้มข้นของสารละลายสูงสุด แต่ก็พบว่า เมื่อต้นงอกแล้วสามารถเจริญต่อไปได้ โดยมีเปอร์เซนต์รอดตายทั้งหมด ดังนั้นน่าจะมีความเป็นไปได้ที่จะทดสอบระยะเวลา และ/หรือ ความเข้มข้นเพิ่มขึ้นเพื่อชักนำให้เกิดจำนวนชุดโครโมโซมเพิ่มขึ้น

การทดลองของต้อยติ่ง พบว่าการแช่เมล็ด 1 หรือ 2 วัน มีจำนวนวันเฉลี่ยเมื่อเริ่มงอกเท่ากัน แต่เมื่อแช่ 2 วัน ใช้เวลาน้อยกว่าเพื่อให้เมล็ดงอกสูงสุด ที่เป็นเช่นนี้อาจเป็นเพราะเมล็ดต้อยติ่งเมื่อแช่น้ำมีเมือกเก็บน้ำให้ชื้นตลอดเวลาจึงเร่งการงอกในระยะหลังของการงอกดีกว่า ซึ่งการรอดตายจากผลของโคลชิซีนความเข้มข้น 0.20 % มีความแตกต่างจากความเข้มข้นอื่นโดยมีค่าเฉลี่ยเพียง 25.00 % แสดงว่าความเข้มข้นระดับนี้สูงเกินไปจนเป็นอันตราย ส่วนคุณภาพของยอดต้อยติ่งเมื่อทำการตัดเลี้ยงบนอาหารสูตร MS (1962) ดัดแปลง เพื่อดูความคงตัว และการขยายต้นต่อไป แสดงผลไปในทำนองเดียวกับในแง่การเกิดราก หรือเกิดต้น คือ ในการย้ายครั้งแรกใช้เวลานานกว่าการเกิดราก หรือ เกิดต้นจากการย้ายครั้งที่สอง (ตาราง 19) ที่เป็นเช่นนี้น่าจะมาจากผลของโคลชิซีนที่มีอิทธิพลในต้นลดลงไปแล้วในการย้ายครั้งที่สอง โดยผลที่ได้เป็นไปในทิศทางเดียวกับกับการทดลองของ Bragdo (1955) ที่รายงานถึงการยับยั้งการเจริญ และพัฒนาของราก ต้น red clover ภายหลังการใช้สารละลายโคลชิซีนแก่เมล็ด ผลนี้สามารถใช้ผลของความเข้มข้น 0.025 % และไม่ให้โคลชิซีนซึ่งใช้จำนวนวันเกิดรากเพียง 8 วันเท่ากัน มาสนับสนุนได้

การนับจำนวนโครโมโซมพบว่ามีความแตกต่างกันน้อยมากระหว่างการแช่เมล็ดในสารละลาย 1 หรือ 2 วัน โดยพบเปอร์เซนต์การเกิดโครโมโซมแบบ aneuploid ไม่ถึง 20 % (ตาราง 11) และในการตัดยอดเพื่อหาจำนวนโครโมโซมจากปลายรากของต้นการย้ายปลูกครั้งที่สอง พบต้นที่ยังคงลักษณะของ aneuploid จากการแช่สารละลาย 2 วัน เพียงต้นเดียวจากทั้งหมด หรือ 4.55 % โดยมีจำนวนโครโมโซมเท่ากับ 32 แท่งซึ่งเป็น aneuploid แบบลดลง (2n-2) (ตาราง 12) แต่ก็ไม่พบเมื่อทำการตัดย้ายอาหารครั้งต่อมา

การชักนำให้จำนวนโครโมโซมเปลี่ยนไปด้วยสารละลายโคลชิซีน ทำได้ยากในพืชต้อยติ่ง เพราะหากใช้ความเข้มข้นสูงก็จะทำให้ต้นตาย ซึ่ง สอดคล้องกับการทดลองของบุษรา (2536) ที่ได้ทำการทดลองกับว่านหางจระเข้ (Aloe barbadensis) และหากต้องการต้นที่มีจำนวนโครโมโซมเหมือนเดิม หลังการถูกชักนำแล้ว น่าจะหาวิธีชักนำให้ต้นพืช regenerate โดยผ่านเซลล์เดียว (ผ่านกระบวนการเกิด embryoid แล้วจึงตัดขยายเพิ่มปริมาณในภายหลัง ซึ่งในการทดลองครั้งต่อไปน่าจะยืดเวลาการแช่นานขึ้น โดยไม่เพิ่มความเข้มข้นของสารละลาย

จากผลการทดลองในดอกดาว แม้ว่าผลของระยะเวลาการเริ่มงอกจะไม่ต่างกัน แต่ให้ผลชัดว่าการแช่เมล็ดนานทำให้ใช้เวลาน้อยในการงอกทั้งหมด เพราะน้ำและสารละลายช่วยให้เมล็ดงอกได้พร้อมกันเร็วขึ้น นอกจากนี้ยังให้ผลชัดเจนต่อเปอร์เซนต์การรอดตาย (ตาราง 25) แสดงว่าเมื่อใช้เวลา 2 วัน แช่เมล็ดจะนานเกินไปจนเมล็ดส่วนหนึ่งได้รับอันตราย ซึ่งเปอร์เซนต์การรอดตายต่ำพบได้ในทำนองเดียวกับเมื่อเพิ่มความเข้มข้นของสารละลายสูงสุด และผลร่วมระหว่างเวลานาน 2 วัน และความเข้มข้นนี้ส่งเสริมกัน เมื่อใช้พร้อมกันโดย พบว่าไม่มีเปอร์เซนต์รอดตายเลย (ตาราง 35) อย่างไรก็ตามที่ระดับของปัจจัยร่วมคือใช้โคลชิซีนความเข้มข้น 0.15 และ 0.20 % กับระยะเวลาการแช่เมล็ดนาน 2 วันนี้ แม้ว่าจะเป็นอันตรายต่อการรอดตายดอกดาวนี้ แต่มีผลให้สามารถชักนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงจำนวนโครโมโซมแบบเพิ่ม และลดจำนวนรวมกันได้มากกว่า เมื่อใช้ปัจจัยร่วมระดับอื่น แม้ว่าจำนวนโครโมโซมที่พบจะสูงถึง 50 แท่ง แต่ก็ไม่พบต้นที่มีโครโมโซมเพิ่มแบบครบชุดเลย ผลการทดลองนี้ชี้แนะว่าการทดลองต่อไปน่าจะใช้จำนวนประชากรจำนวนมาก เพื่อชักนำต้นที่รอดตายให้เพิ่มจำนวนโครโมโซมให้ได้ตามที่ต้องการ ได้แก่ 3 ชุด และ 4 ชุด ซึ่งโดยทั่วไปมักจะให้ดอกที่มีขนาดใหญ่กว่าปกติ

ต้นที่พบว่ามีจำนวนโครโมโซมเปลี่ยนไป มักไม่แสดงผลนี้ต่อเนื่องในการตัดย้ายครั้งที่ 2 แสดงว่าการเปลี่ยนแปลงจำนวนโครโมโซมจากเซลล์รากเป็นเฉพาะเซลล์ และเซลล์นั้นไม่มีโอกาสเกิด (regenerate) เป็นรากใหม่ได้ และยังชี้ให้เห็นว่าหากปลายยอดมีจำนวนโครโมโซมเปลี่ยนไปจริง (ซึ่งไม่ได้นำมาหาจำนวนโครโมโซม) รากที่เกิดที่มีจำนวนโครโมโซมไม่คงที่ในการตัดย้ายครั้งที่ 2 นี้ก็ไม่ได้เกิดจากยอดนั้น เพราะหากรากเกิดจากยอดนั้นจริง จำนวนโครโมโซมน่าจะคงที่

ผลการทดลองในแง่ของการเกิดข้อใหม่แสดงให้เห็นว่าทั้งเวลาการแช่นาน และความเข้มข้นของสารละลายที่สูงมีแนวโน้มทำให้ต้องใช้เวลาการเกิดยอดใหม่นานขึ้น ที่เป็นเช่นนี้อาจเป็นเพราะความเข้มข้นของโคลชิซีนที่ใช้ มีผลกระบวนการแบ่งเซลล์ของเนื้อเยื่อที่เลี้ยง และยังพบว่าการเกิดยอดใหม่จากต้นที่พบจำนวนโครโมโซมเพิ่มมากถึง 50 แท่ง ไม่สามารถทำการตัดย้ายได้สำเร็จ เนื่องจากต้นนั้นหยุดการเจริญ และเกิดอาการเนื้อเยื่อเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาล และตายไประหว่างการเลี้ยงเนื้อเยื่อ

ในทุกการทดลองกับทุกพืชนี้ พบจำนวนโครโมโซมที่ต่างไปจากปกติ โดยพบแบบ aneuploid เท่านั้นไม่พบจำนวนโพลีพลอยด์ในลักษณะอื่นเลย ซึ่งแตกต่างไปจากการทดลองอื่นที่มักพบจำนวนโครโมโซมแบบโพลีพลอยด์ ในลักษณะที่เพิ่มจำนวนโครโมโซมทั้งชุด เช่นในการทดลองของ Sangowawa (1994) ซึ่งทำการแช่เมล็ดมันฝรั่ง (Solanum melongena cv.Giwa) ในสารละลายโคลชิซีนความเข้มข้น 0.4 % ในระยะเวลา 2 , 4 , 6 และ 8 วัน ซึ่งพบเซลล์ที่เป็น tetraploid 1.26 % และรายงานเพิ่มเติมถึงการเกิด chromosome aberration เช่นการเกิด translocation , anaphase bridge และการเคลื่อนที่ที่ช้าลงของโครโมโซมที่จับคู่กันแบบ bivalant ในกระบวนการแบ่งเซลล์แบบ meiosis ซึ่งความผิดปกติของโครโมโซมในลักษณะที่กล่าวมานี้พบในกรรมวิธีที่ใช้เวลาการแช่เมล็ดในสารละลายโคลชิซีน 4 และ 6 วัน การเกิด chromosome aberration จนส่งผลให้ โครโมโซมเปลี่ยนแปลงไปในลักษณะของ anueploid นี้ เป็นลักษณะปกติที่มักจะเกิดขึ้นจากการชักนำด้วยสารละลายโคลชิซีน โดยเกิดจากการแบ่งเซลล์แบบหลายขั้ว (multipolar division) ในนิวคลีอายของพืชที่เป็น polyploid นั้นๆ (Dermen, 1940 อ้างถึง Nebel and Ruttle, 1938) ซึ่งสามารถพบได้ใน Dutara เป็นต้น (Dermen, 1940 อ้างถึง Blakeslee and Avery, 1938)

ส่วนในการทดลองอื่นที่มีรายงานถึงการเกิด aneuploid เช่นการทดลองของ วุฒิพงษ์ (2539) ซึ่งทดลองแช่ส่วนยอด (shoot-tip meristem) ของกระเทียมพันธุ์ศรีสะเกษ (2n=16) ด้วยสารโคลชิซีนเข้มข้น 100 สตล และ 200 สตล พร้อมกับเติมสาร dimethy sulfoxide (DSMO) 3% ใช้เวลาการแช่นาน 1 , 3 , 7 และ 10 วัน แล้วนำไปเลี้ยงต่อในสูตรอาหารดัดแปลงของ MS (1962) ที่เติม BAP 0.4 สตล และ NAA 0.5 สตล พบต้นที่มีจำนวนโครโมโซม แบบ aneuploid เพียง 1 ต้น คือ ต้นที่ใช้สารละลายโคลชิซีนเข้มข้น 100 สตล ที่ระยะเวลา 7 วันโดยนับจำนวนโครโมโซมได้ 44-46 แท่ง

จากผลการทดลอง ที่ต้นช่อทับทิมพบจำนวนโครโมโซมแบบ aneuploid เพียงอย่างเดียวและพบในอัตราที่สูงถึง 11.25 % (เฉพาะกรรมวิธีที่ให้สารละลายโคลชิซีน) โดยไม่พบการเพิ่มจำนวนโครโมโซมแบบ euploidy อาจสันนิษฐานได้ว่าผลที่เกิดขึ้นได้จากการที่ต้นช่อทับทิม ซึ่งเดิมแล้วเป็นต้นไม้ที่เป็นทริพพลอยด์อยู่แล้ว ซึ่งจากการที่พืชเป็นโพลีพลอยด์อยู่แล้ว การเพิ่มชุดโครโมโซมอีกอาจทำให้เซลล์ที่มีจำนวนโครโมโซมมากชุดเกินไปไม่สามารถเจริญต่อไปได้ (วิมล, 2527) และเซลล์อื่นซึ่งเป็นเซลล์ปกติที่ไม่ถูกสารละลาย หรืออยู่ในเข้าไปในเนื้อเยื่อจนได้รับผลน้อย หรือไม่มีผลต่อสารละลายที่ให้ สามารถเจริญเบียดแทรกจนพัฒนากลายส่วนเจริญแทนส่วนเจริญ (ยอดจากหัวย่อย) ที่ต้องการได้ จนเป็นผลให้พบเซลล์ปกติในอัตราส่วนที่สูง ซึ่งสอดคล้องกับที่ Dermen (1940) ได้กล่าวถึงการชักนำด้วยสารโคลชิซีนแล้วไม่ได้ผล โดยมักเป็นผลมาจากการที่สารโคลชิซีนเองไม่สามารถผ่าน หรือซึมเข้าไปยังกลุ่มเนื้อเยื่อเป้าหมายได้ หรือการที่เนื้อเยื่อนั้นๆ มีความต้านทานต่อสารชนิดนี้สูง